何为功能富集分析？

功能富集分析是将基因或者蛋白列表分成多个部分，即将一堆基因进行分类，而这里的分类标准往往是按照基因的功能来限定的。换句话说，就是把一个基因列表中，具有相似功能的基因放到一起，并和生物学表型关联起来。

何为GO和KEGG？

为了解决将基因按照功能进行分类的问题，科学家们开发了很多基因功能注释数据库，。这其中比较有名的一个就是Gene Ontology（基因本体论，GO）和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（京都基因与基因组百科全书，KEGG）。

其中，GO是基因本体论联合会建立的一个数据库，旨在建立一个适用于各种物种的、对基因和蛋白功能进行限定和描述的、并能够随着研究不断深入而更新的语义词汇标准。GO注释分为三大类：分子生物学功能（Molecular Function，MF）、生物学过程（Biological Process，BP）和细胞学组分（Cellular Components，CC），通过这三个功能大类，对一个基因的功能进行多方面的限定和描述。

而KEGG，大多数人会将其当做一个基因通路（Pathway）的数据库，其实KEGG的功能远不止于此。KEGG是一个整合了基因组、化学和系统功能信息的综合数据库。KEGG下属4个大类和17个子数据库，而其中有一个数据库叫做 KEGG Pathway，专门存储不同物种中基因通路的信息，也是用的最多的一个，久而久之，KEGG被大家当做一个通路数据库了。

下面两个图展示了GO和KEGG Pathway的面貌。

如何做功能富集分析？

做功能富集分析的算法有很多，能够做功能富集分析的工具也非常多，见下面的列表

 Funrich 也可以做功能富集分析

以上的工具中，DAVID最为常用也最为权威。DAVID是由美国Leidos生物医学研究公司的LHRI团队开发的一个在线基因注释及功能富集网站（https://david.ncifcrf.gov/）

使用DAVID做功能富集分析

第一步

打开DAVID官网：https://david.ncifcrf.gov/

点击左侧功能菜单：Functional Annotation

 进入到如下的页面中，页面中的红框中就是进行分析所用的主要操作区域。

 第二步

进入分析页面后，通过如下三步即可完成分析：

提交基因列表 –> 选定提交列表类型 –> 开始分析

具体操作如下：

(1) 在 “Enter Gene List” 中上传基因列表，格式是每行一个基因。按照 DAVID 的要求，总的基因个数不得超过 3000 个。

(2) 在 “Select Identifier” 中选择上传的基因类型，因为我们上传的是基因名（Gene Symbol），所以在下拉菜单中选择 “OFFICIAL_GENE_SYMBOL”

(3) 在 “List Type” 中有两个单选框，我们统一选择 “Gene List” 这一项

(4) 点击 “Submit List” 即可

 点击 “Submit” 提交基因列表之后，经过几秒钟的等待，如果分析顺利，就会弹出下面一个提示（如下图所示）：Please note that multiple species have been detected in your gene list. 这句话的意思就是在我们提交的基因列表中检测到多个物种，需要我们选择相应的物种。怎么选择物种？点击弹出框中的 “确定”，然后在 “List” 中的选择相应物种，这里我们选择 “Homo sapiens”，并点击下方的 “Select Species” 即可。

第三步

操作完成后，就可以得到如下图所示的分析结果。红框所示折叠框中分别就是GO和KEGG的分析结果。

第四步

做完了分析，我们就来看看如何提取结果，并实现结果的可视化吧。

如下图所示，在功能富集分析的结果中有多个折叠栏，其中 Gene_Ontology 这一折叠栏中有有三个栏目：GOTERM_BP_FAT、GOTERM_CC_FAT、GOTERM_MF_FAT 就是我们想要的 GO 功能富集分析结果。而 Pathways 里面有一个 KEGG_PATHWAY 就是我们想要的结果。如何找到 BP、CC、MF 和 KEGG 对应的详细结果呢？ 点击每个栏目后面的 “Chart” 即可。

 点击 “Chart” 之后，即可出现如下图所示的结果，这里面有几列数据分别是：Category、Term、RT、Genes、Count、%、P-Value 和 Benjamini。这几列中我们比较关心的是：Term（GO语义）、P-Value（P值）、Count（基因数）、%（基因比例）。后面我们要解决的问题是，如何将这些结果下载下来？点击红框中的 Download File 即可。打开一个新的网页，新打开的网页就是分析结果的文本文件，可以下载或者导入到作图软件中进行后续的操作。

第五步 结果导出和可视化

阅读文献时，大家遇到最多的就是柱状图（一般是水平柱状图），柱子的高低与 P-value 相关，柱子越高则越显著。

高级气泡图用来表征富集分析的结果，x轴是 Gene Ratio，对应的就是 DAVID 结果表格中的 % 一列；y轴是富集出来的通路或者 GO Term；点的大小表示 Gene 数；点的颜色最为重要，代表 P值的高低。